专家点评Cell丨陈玲玲团队揭示环形RNA在天然免疫过程中的重要功能

编者按

近年来，围绕“环状RNA”的研究工作越来越受到重视与关注甚至是热捧，以中科院生化细胞所陈玲玲研究员为代表的一批国内的优秀科学家近年来在“环状RNA”领域做出了系列重要的工作，然而由于“环状RNA”在生物体内功能不祥的原因，依然有许多研究同行对相关领域抱有半信半疑的态度，尽管2017年Rajewsky研究组在Science上发文表明了一类“环状RNA”在小鼠体内缺失会导致异常的神经元活性和行为障碍。围绕“环状RNA”生物学功能的研究显然需要进一步的推动。4月25日，陈玲玲课题组、杨力课题组与上海交大附属仁济医院的沈南研究组合作在Cell发表了最新的研究成果，研究揭示了环形RNA在自体免疫中的重要功能，并首次解析了环形RNA的调控作用机制。鉴于该工作的重要意义，BioArt特邀请到了南开大学校长曹雪涛院士和美国国立卫生研究院郑志明高级研究员对上述研究进行了深度点评，以飨读者！

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点评 | 曹雪涛（南开大学校长），郑志明（美国国立卫生研究院PI）

责编 | 酶美

环形RNA来自外显子反向剪接，以共价键形成闭环结构。科学家在真核生物中发现了多达几十万条环形RNA，但大部分环形RNA的功能至今不详。环形RNA分子的特殊结构使得研究存在很多难点，例如它们是如何在体内被降解的？它们的闭环结构可否使其作为一个整体发挥某种特殊的生物学功能？这些研究难点的突破将为深入理解环形RNA的生物学意义奠定基础 【1，2】。

2019年4月25日，中科院生化细胞所陈玲玲研究员与中科院-马普学会计算生物学伙伴研究所杨力研究员以及上海交通大学医学院附属仁济医院沈南研究员合作在Cell上发表了题为Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity 的研究论文。首次阐述了环形RNA在细胞受病毒感染时的降解机制，及其通过形成分子内双链结构结合天然免疫因子参与抗病毒免疫的重要新功能，并揭示环形RNA低表达与自身免疫性病——系统性红斑狼疮(SLE)密切相关。该工作为环形RNA在天然免疫中的重要功能研究奠定基础，并为自身免疫病的临床诊断和治疗提供了新思路。

在这项最新的研究中，科研人员首次发现并解析了环形RNA形成16-26 bp的双链RNA茎环结构，并以此为基础结合天然免疫因子PKR（double-stranded RNA-activated protein kinase，双链RNA依赖性蛋白激酶 ）的特性。在正常细胞状态下，参与抗病毒的PKR分子被束缚在环形RNA分子的茎环结构上，活性受到抑制，避免了过度激活引起机体的免疫反应（下图上）。而当细胞被病毒感染时，RNase L在病毒刺激下可以作用于环形RNA，将其切割降解（下图中）。而缓慢的环形RNA生成速度不足以回补这些被降解的环形RNA，PKR被释放参与到细胞的抗病毒免疫过程中。

系统性红斑狼疮是一种自体免疫疾病。研究人员对系统性红斑狼疮病人来源的外周血单核细胞分析表明，在病人体内环形RNA数量很低（上图）；而对环形RNA行使切割功能的RNase L处于弱激活状态。与之对应，天然免疫因子PKR及其下游免疫信号通路则在体内过度激活运转。研究人员通过技术手段增加环形RNA数量，则可以显著抑制病人来源外周血单核细胞和T细胞中的PKR活性及其下游免疫信号通路。

这些发现不仅首次揭示了环形RNA的降解途径及其特殊二级结构特征，并提示环形RNA发挥免疫调控的全新功能。相关研究进展为环形RNA代谢和功能研究奠定了重要基础，也为红斑狼疮等自身免疫病的临床诊断和治疗提供了新思路。

陈玲玲研究员与论文的主要作者合影。

据悉，生化与细胞所博士后刘楚霄、博士研究生李响和中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所博士研究生南芳为该论文的共同第一作者，陈玲玲研究员是首要通讯作者(Lead Contact)、中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所杨力研究员和上海交通大学医学院附属仁济医院沈南研究员为该论文的共同通讯作者。

陈玲玲教授研究组长期从事长非编码RNA(lncRNA)研究。前期和杨力研究员合作创建并利用RNA研究的新技术手段【3】，相继发现几类具有特殊结构的新型RNA家族，包括以snoRNA结尾的sno-lncRNAs、SPAs家族【4，5】和两类环形RNA家族【6，7】，并揭示它们全新的生成加工过程、在基因表达调控中的功能以及与人类疾病密切关联【8，9，10，11，12】。这一系列原创性工作揭示了哺乳动物转录组的复杂性和lncRNA的多样性及重要功能，开拓了非编码RNA研究的新方向【13，14】。

值得一提的是，据陈玲玲研究员透露，上述工作在投稿之前已经在2018年下半年的几个重要国际场合（包括德国的EMBO会议和苏州的亚洲冷泉港会议）做过报告，而前来参会的杂志编辑听完陈老师的报告后认为意义重大而直接邀请投稿。整个论文投稿Cell到最终发表时间不算太长，相对而言是比较顺利的。

专家点评

曹雪涛（中国工程院院士、南开大学校长、中国医学科学院免疫治疗研究中心主任、海军军医大学医学免疫学国家重点实验室主任）

环状RNA抑制天然免疫炎症反应的新机制

机体细胞具有多种天然免疫应答机制，能够准确快速地感知外界病原体入侵并启动免疫炎症反应以清除病原体，同时，机体还存在着与之相对应的负向免疫调控机制以维持正常内环境稳定和及时终止免疫炎症反应以防止机体自身炎症性损害，对于天然免疫应答与炎症及时消退的研究一直是免疫学领域的前沿热点。近年来研究发现，circRNA（circular RNA，环状RNA）参与天然免疫与炎症的调控，但其作用机制尚不清楚。

环状RNA是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，目前发现其广泛存在于多种真核生物体内并发挥着重要的生物学作用。环状RNA具有线性RNA不具有的两个特征：一是环状RNA主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA外切酶影响，表达更稳定且不易降解，目前对于环状RNA在体内如何降解的机制还知之甚少，推测是否是细胞内的RNA内切酶介导了环状RNA的降解，但目前尚未找到实例证明这一假设；二是环状RNA具有区别于线性RNA的环状结构特征，由于环状RNA覆盖了同源线性RNA的碱基序列，因此，对于环状RNA结构的解析、环状RNA与结构特点相关的不同于线性RNA的功能研究均存在很多困难。可见，克服目前环状RNA研究技术的瓶颈、发展新的用于特定靶向环状RNA的研究体系，对于环状RNA结构与功能研究具有重要意义。

近年来，中国科学院生物化学与细胞生物学研究所陈玲玲课题组和中科院计算生物学研究所杨力课题组密切合作，在非编码RNA领域取得了一系列有国际影响力的创新性研究成果。2018年该联合研究组受邀在Molecular Cell合作发表了综述文章，对环状RNA的生成加工、功能机制等进行了系统总结和梳理，讨论了环状RNA研究技术上存在的局限和挑战。

4月25日最新一期Cell杂志在线发表了陈玲玲课题组、杨力课题组与上海交通大学医学院附属仁济医院沈南课题组合作完成的题为 Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity 的研究论文，该工作阐明了环状RNA的降解机制，解析了内源环状RNA的结构，并把环状RNA与天然免疫应答调控机制以及炎症性自身免疫疾病（系统性红斑狼疮）发病机制联系在一起开展研究，为免疫炎症的自身调控方式提出了新的观点，也为炎症性自身免疫疾病发病机制及未来的干预治疗提出了新的思路与潜在靶点。

首先，该研究团队观察到病毒感染的细胞内环状RNA能够被快速降解， 在此基础上，发现了活化的核酸内切酶RNase L介导了环状RNA降解。该团队进一步研究了环状RNA降解在天然免疫与炎症反应中的作用，结果发现，环状RNA在正常情况下能够优先结合双链RNA依赖的蛋白质激酶（PKR）并抑制其活化，从而能够抑制作为天然免疫受体的PKR所触发的免疫炎症反应，首次提出环状RNA是PKR的内源性抑制分子，在正常情况下起到抑制免疫炎症的作用。应用SHAPE-MaP方法，发现环状RNA的结构与同源线性RNA相比非常稳定，且内部长度为16-26个碱基对（bp）的短双链RNA是结合PKR的关键结构。带有短dsRNA结构的环状RNA与PKR结合后，抑制了病原体dsRNA激活的PKR活性， 揭示了环状RNA作为PKR内源性抑制分子的结构基础。由此推论，在天然免疫应答早期，被激活的RNase L通过降解环状RNA，解除了环状RNA对PKR的抑制作用，从而活化了PKR参与的天然免疫炎症反应。

该团队从转化医学的角度，结合I型干扰素产生异常增多的炎症性临床疾病——自身免疫性红斑狼疮（SLE）患者加以分析与验证，结果表明，SLE患者外周血细胞中环状RNA水平及种类均显著降低，而RNase L和PKR活性增强，这些与患者炎症性细胞因子产生增多的表征是一致的；此外，在SLE患者外周血细胞中过表达含有dsRNA结构的环状RNA能够显著抑制PKR的活性，从而进一步证明环状RNA抑制天然免疫炎症反应的生理作用及其在炎症性免疫疾病发生发展中的病理意义，也为SLE的临床发病机制提出了环状RNA参与的新型机制。

最后，热切期待中国学者在环状RNA研究领域继续开展系统性创新性研究，在理论、技术及临床转化应用方面不断取得更多突破性的进展。

专家点评

郑志明（美国国立卫生研究院高级研究员）

注：下列内容根于英文点评原文翻译，原文详见文末

细胞内具有多种天然免疫应答机制，主要存在两类识别外源RNA入侵的天然免疫识别受体。一类是免疫感受器模式识别受体（Immune sensing receptors）能够识别含有5’三磷酸修饰的单链RNA和部分双链RNA从而通过激活细胞因子产生并启动免疫炎症反应以清除病原体RNA。这一类免疫感受器模式识别受体包括RIG-I (retinoic acid-inducible gene I)，MDA-5 (melanoma-differentiated gene 5) 以及 TLRs (Toll-like receptors)。另一类为能够直接识别不同长度不同结构的双链RNA的核酸受体（Nucleic acid receptors），并通过抑制病原体RNA翻译、诱导病原体RNA降解或特异性修饰病原体RNA的方式发挥抗病毒RNA的作用。这类核酸受体包括PKR (dsRNA-activated protein kinase R)，OAS (oligoadenylate synthetase) 和 ADAR1 (adenosine deaminase acting on RNA 1)等。

环形RNA来主要来自于前体mRNA（pre-mRNA）通过外显子反向剪接形成，以共价键形成闭环结构。科学家在真核生物中发现了多达几十万条环形RNA，但是环形RNA反向剪接的效率很低（小于经典剪接效率的1%），且大部分环形RNA的功能至今不详亟待研究。同时，环形RNA主要位于细胞质中不受RNA外切酶的影响，更加稳定不易降解。4月25日最新一期Cell杂志在线发表了中科院生化与细胞所陈玲玲研究组合作完成的题为“Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity”的研究论文首次揭示环形RNA降解和结构调控天然免疫应答。

首先，研究人员发现在双链RNA病毒模拟刺激物poly(I:C)或直接用EMCV（encephalomyocarditis）病毒感染的细胞内，绝大部分环形RNA快速降低，其半衰期仅在1小时左右。这些环形RNA在响应poly(I:C)刺激情况下的快速降低并不是来源于转录水平的下降，而是被快速降解。进而，研究人员发现了活化的核酸内切酶RNase L介导了环形RNA的快速降解。已有报道证明，病原体双链RNA能够结合并激活OAS蛋白质因子从而产生2’, 5’-linked oligoadenylates (2-5A)进而激活核酸内切酶RNase L介导的病原体和宿主RNA来降解限制病原体RNA的感染。通过构建RNase L敲除的细胞系结合高通量测序，研究人员证明RNase L是介导细胞在poly(I:C)或EMCV感染时环形RNA快速降解的关键内切核酸酶。

进一步通过体外结合/竞争性结合实验，研究人员发现核酸受体包括PKR，OAS和ADAR1相对于线性RNA更倾向于结合环形RNA，而免疫感受器模式识别受体包括RIG-I，MDA-5和TLR3则更倾向于结合线性RNA。有趣的是，研究人员发现环形RNA不仅结合PKR，还能够有效的抑制由79bp双链RNA所引起的PKR的激活，而同序列的线性RNA基本没有抑制作用。这些发现引导他们继续探索环形RNA分子结构与调控PKR激活的关系。通过建立circSHAPE-MaP，研究人员解析了大多数环形RNA倾向于形成1到4个16-26 bp的双链RNA茎环结构，并证明环形RNA以此结构为基础在细胞内可以作为PKR的抑制分子。

最后，研究发现炎症性临床疾病—自身免疫性疾病系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单核细胞（PBMC）中环形RNA表达水平及数量均显著降低，而PKR的活性显著增强，RNase L的也有一定程度的激活；此外，在SLE患者外周血单核细胞或T细胞中过表达含有dsRNA结构的环形RNA能够抑制PKR的活性，从而进一步证明环形RNA具有抑制天然免疫炎症反应的生理作用，也提示环形RNA可能参与SLE发生的新机制。

该工作不仅阐明了环形RNA的降解机制，也发现环形RNA本身具有的双链RNA茎环结构使之能够以类似于线粒体来源的mtRNA或IRAlus的等双链RNA调控PKR活化的新机制。同时，该工作也为后续继续开展环形RNA相关研究提出了很多有趣的问题：例如细胞核内外显子反向剪接产生环形RNA之后，环形RNA即折叠成双链茎环结构还是在其被转运出核后才折叠形成相应的结构？如果是在细胞核内已经形成该结构，又有什么核内的蛋白质因子辅助环形RNA折叠并发生相互作用？环形RNA是通过怎样的机制被运输出核并与PKR结合的？在病毒感染初期，是PKR还是RNase L先激活？就目前的研究表明，环形RNA的快速降解可能先于PKR的激活，而且这一过程有利于PKR的活化。尽管未来仍存在很多挑战，这一最新的发现毋庸置疑地开启了环形RNA研究的新篇章。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.03.046

制版人：珂

参考文献

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14. Wu H, Yang L, Chen LL.The Diversity of Long Noncoding RNAs and Their Generation. Trends Genet. 2017, July; 33(8), 540-552.

附：郑志明研究员评论原文

Intracellular foreign RNAs are recognized by two groups of intracellular RNA sensors. Immune sensing receptors recognize 5′-triphosphate (ppp) ssRNA and short dsRNA to induce immune responses via activation of transcription and production of cytokines. This group includes RIG-I (retinoic acid-inducible gene I), MDA-5 (melanoma-differentiated gene 5) and TLRs (Toll-like receptors). Nucleic acid receptors directly recognize and act on dsRNAs in different size to execute antiviral activities by blocking translation and inducing degradation and modification of pathogenic dsRNA. The latter group includes PKR (dsRNA-activated protein kinase R), OAS (oligoadenylate synthetase) and ADAR1 (adenosine deaminase acting on RNA 1).

A large number of circular RNAs (circRNAs) produced from primary mRNA (pre-mRNA) splicing in eukaryotic cells are the splicing intermediate intronic lariats and exon back-splicing products. Although the circular lariats are commonly produced by splicing of each pre-mRNA intron, the back-splicing derived circRNAs are considerably in low production efficiency (<1% of canonical splicing) and their functional potential of the back-splicing derived circRNAs remains elusive. Due to their circular form, circRNAs are relatively stable and resistant to linear RNA decay machineries in eukaryotic cells. In this issue of Cell published online on April 25, 2019, Chu-Xiao Liu and Lingling Chen, et al., from Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, reported their astonishing discoveries on structure and degradation of the back splicing-derived circRNAs regulate PKR activation in innate immunity (Cell 177, 2019). In this report, the authors found that stimulation of HeLa cells with poly I:C, being widely used to mimic pathogenic dsRNAs, or viral infection with the RNA virus, encephalomyocarditis (EMCV), led to dramatic and rapid reduction of all examined circRNAs with a turnover half-life of ~1 h. The observed fast turnover of circRNAs upon poly I:C treatment was not due to the transcriptional level interference, but specific to poly I:C and EMCV. The catalytic activity of RNase L was essential for circRNA degradation. It has been known for long time that pathogenic dsRNA binds to and activates OAS to produce 2’, 5’-linked oligoadenylates (2-5A) which then activate a cytoplasmic ribonuclease RNase L to catalyze the degradation of viral and host RNAs to restrict virus infection. By knockout (KO) of RNase L expression in HeLa cells, Liu and her two mentors, Li Yang and Lingling Chen, discovered that the activated RNase L is the key enzyme for circRNA degradation upon poly I:C stimulation or EMCV infection.  

Further investigation to identify the circRNA-associated proteins revealed that the circRNAs, both circPOLR2A and circCAMSAP1, preferentially bind to nucleic acid receptors PKR, NF90 and OAS, whereas their linear RNA forms bind to immune-sensing receptors TLR3, RIGI and MDA5. Interestingly, this binding of circPOLR2A to PKR could be blocked by a short 33-bp dsRNA of which binding doesn’t activates PKR, but the same short RNA in linear form had no effect. These observations led the investigators looking into the question whether the circRNAs could form intramolecular RNA duplexes to bind and activate PKR. Surprisingly, this group discovered that each HeLa cell may contain ~9000-10000 copies of circRNAs and each circRNA bears at least 1-4 intra-dsRNA regions in size of 16-26 bps, leading the authors to hypothesize that the short dsRNA region in a circRNA binds PKR in normal cell condition, but not activates PKR because of its short size and thus functions as a PKR suppressor. Further experimental approaches by ectopic expression of circRNAs or by stimulation of RNase L KO cells with poly I:C confirmed this important role of circRNAs in suppression of PKR activation and in innate immunity against EMCV infection.

More strikingly, the author in this report discovered a higher level of the activated PKR, some degree of spontaneously activated RNase L, and the reduced level of circRNAs in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from systemic lupus erythematosus (SLE) patients over that from the normal control individuals. Ectopic expression of circPOLR2A in T cells isolated from SLE patient could block PKR phosphorylation and PKR activation. SLE is an autoimmune disease and is characterized by production of numerous auto-antibodies and type I IFN. These important observations in SLE patients, provide the strong evidence that imbalanced production and function of the identified circRNAs might be related to the pathogenesis of autoimmune diseases.

Together with the findings of circRNA binding PKR and sensitive to RNase L digestion, the study proposes a paradigm-shift model on how endogenous circRNAs may function to sponge abundant dsRNA-binding PKR in a cell to prevent PKR activation by endogenous dsRNA such as mitochondria-derived mtRNAs and inverted Alu repeats-derived IRAlus. However, the report also raises many questions than answers for future investigation. For example, PKR is primarily a cytoplasmic protein and RNA back-splicing is a nuclear event. Are the intramolecular RNA duplexes in a circRNA folded immediately after back-splicing in the nucleus or later in the cytoplasm? If in the nucleus, what nuclear proteins are in association with a newly formed circRNA? How does a circRNA export from the nucleus to the cytoplasm for cytoplasmic PKR interaction? During virus infection or poly I:C stimulation, which dsRNA-binding factor is activated first, RNase L or PKR? According to the proposed model, degradation of circRNAs by activated RNase L is perhaps a prerequired step to free PKR from the bound circRNAs. Although to address each of these questions will be a challenging, prospective topic, the reported study definitely opens a new avenue guiding the next wave of discoveries in circRNA research. 

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